摘 要

本文旨在研究1064nm皮秒激光高能辐照后，微透镜阵列（MLA）和衍射光学元件（DOE），通过真皮内激光诱导的光击穿（LIOB）对皮肤组织的影响。在调光纸、组织模型和深色猪皮上测试MLA和DOE的辐射，定量比较微束、微气泡和激光诱导的空泡在皮肤中的分布。与MLA相比，DOE在纸上产生的微光束分布更均匀，并且在模型中也产生了激光诱导的微气泡。体外皮肤实验证实，与MLA辅助照射（偏差~26%和~163μm）相比，DOE辅助照射在组织表面产生的微束更均匀（偏差为≤3%），且真皮中有高密度的激光诱导小空泡（~78μm）。真皮内LIOB后，DOE辅助的皮秒激光辐照可使基底膜下形成深度均匀的空泡化，从而实现有效的皮肤分级治疗。

引言

黄褐斑是一种色素性疾病，主要发生于面部的棕色或灰色斑块。引发色素性皮肤病的因素有很多，包括遗传、妊娠、激素功能障碍和紫外线（UV)。但，目前黄褐斑的发病机制尚未完全清楚。黄褐斑在所有人群中都会发生，但是在Fitzpatrick皮肤类型IV~VI中更常发生，因为Fitzpatrick皮肤类型比其他皮肤类型包含更多的色素表型。治疗黄褐斑的方法包括手术、药物、射频和激光治疗。在各种治疗方法中，高功率激光因其无创、治疗速度快和恢复期短等优点，已成为用物理方式破碎皮肤色素治疗黄褐斑的流行手段。因此，也开发了多种波长（532、755和1064 nm）和脉冲持续时间（10-100ns）的Q开关纳秒激光系统，并对其进行了临床试验，较大化提高黄褐斑的治疗效果。然而，纳秒的脉冲持续时间通常长于黄褐斑的热弛豫时间（10-30ns），导致色素的部分热分解会对周围皮肤造成热损伤。

最近，随着技术的进步，皮秒激光系统进入皮肤病学领域，提高了治疗色素性皮肤疾病的临床效果。与传统的纳秒激光系统相比，皮秒激光能够在更短脉冲持续时间（数百皮秒）内产生较高的能量，通过皮肤中的多光子电离产生高温（15,000K）和高压（2GPa），这被称为激光诱导的光击穿（LIOB）。LIOB是一种非线性吸收过程，可在皮肤中产生辐照阈值为102-104 GW/cm2或更高（即亚纳秒范围）范围的等离子体。因此，LIOB期间的高温和高压可能伴随着等离子体膨胀，并伴有可听见的声学特征和冲击波传播，导致皮肤内部出现空泡化。相反，与现有的纳秒激光系统相比，LIOB相关的皮秒激光系统更有利于通过集体机制（光机械和光热）实现色素的破裂和完全热分解。因此，用皮秒激光治疗色素性皮肤的临床目标是通过激光诱导的等离子体，在表皮层和真皮层中均匀地形成空泡，在对周围组织热损伤最小的情况下，去除靶目标。

对于皮肤的分级治疗，皮秒激光通常与微透镜阵列（MLA）一起使用，相比于裸光束，它可以产生多个微光束，且对周围皮肤组织造成的热损伤最小。然而，由于光束不均匀分布的固有光学特征，MLA通常将较大光强度集中在宏观光束的中心，降低两端的光强度。此前的一项体外研究表明，MLA辅助的1064nm皮秒激光在低能量（≤2.1mJ/微束或辐射暴露=2.8 J/cm2）设置下，通过表皮内LIOB诱导空泡不均匀地分散在表皮内(100-150μm)，但这几乎无法治疗位于基底膜附近深层的黑色素（300-500µm）。临床研究表明，在H0=1.2J/cm2时，人类表皮（50-100µm）中大量分布着激光诱导空泡，且空泡仅分布于表皮。衍射光学元件（DOE）作为全息分束器，还可产生多种不同图案的微光束，用于光学成像。DOE可降低入射光的能量，使其均匀化分布。尽管存在能量损失，但光均匀化可以帮助DOE将微束更均匀恒定地传送到目标。光束分布的均匀性很大程度取决于DOE的焦距和入射波长。然而，体外研究显示，DOE辅助的皮秒激光治疗可持续诱导出小空泡（~50μm），但仅局限于人类表皮。因此，由于皮秒激光的脉冲能量不足，往往阻碍了DOE用于真皮内LIOB的分级激光皮肤治疗。

本研究的目的是比较在不同治疗条件下，经1064nm皮秒激光高能照射后，使用MLA和DOE进行皮内LIOB，对体外着色猪皮肤组织的影响。我们假设，在相同的条件下，与MLA相比，具有固有光学模式的DOE可以产生更均匀的微束空间分布和激光诱导的皮肤空泡化。因此，本研究的意义在于比较研究在高能量环境下，经MLA和DOE辅助的皮秒激光照射后，在皮肤组织中诱导形成深度一致的小空泡的好条件，从而有效治疗黄褐斑。离体猪皮肤组织在高能环境下用皮秒激光结合MLA和DOE进行测试，探讨激光诱导的空泡在表皮和真皮层中的分布和范围。之后进行组织学分析，以定量方式比较MLA和DOE之间真皮内LIOB的皮肤反应。

材料和方法

2.1光源

采用1064nm皮秒Nd:YAG激光系统（在FWHM脉冲持续时间=450ps；Picore；Bluecore company，釜山，韩国）在模型和离体猪皮肤组织中诱导LIOB。激光系统提供高达1.1J（1Hz）的脉冲能量，以评估深层色素潜在消融的高能量设置。微透镜阵列（MLA焦距=40mm，37个微光束，直径=4毫米，熔融石英；韩国釜山Bluecore公司）和衍射光学元件（DOE焦距=40mm，49个微光束，长度=4mm，熔融石英；韩国釜山Bluecore公司）在目标表面上产生多个微束，用于定量比较。为了在目标表面上具有相同的能量密度，测试了四种不同的脉冲能量级别的MLA（0.19、0.38、0.57和0.76J）和DOE（0.24、0.48、0.72和0.96J）。相应的微束能量（=施加的脉冲能量/微束数量）在4.9到20.5mJ/微束之间（即，MLA为5.1到20.5mJ/微束，DOE为4.9到19.6mJ/微束）。MLA（圆形）和 DOE（矩形）的整体光斑尺寸都是4mm。为了模拟临床条件（例如，应用的能量密度和皮肤纹理），测试了各种能量密度（H0）和聚焦深度（FD）下的激光照射结果。通过测试四种不同的H0（1.5、3.0、4.5和6.0J/cm2）和三种不同的FD（0、5和10mm），来探讨治疗条件对人体模型和皮肤组织中微束、微气泡以及激光诱导空泡空间分布的物理作用。需要注意的是，FD指的是空气中的聚焦深度，由于没有考虑失配边界条件，所以，FD=0mm意味着入射微束聚焦在目标表面，而FD=10mm表示MLA和DOE距离表面接近10mm（即，接近10mm的距离），将入射微束聚焦在目标表面下方。所有条件下，LIOB在激光照射期间都得到了确认。在各种H0和FD条件下，对于来自MLA和DOE的微束在纸表面上的二维（2D）空间分布，用4×4cm2的黑色调光纸进行可视化和表征。MLA和DOE照射期间，在调光纸上照射一个皮秒脉冲形成LIOB。然后用数码相机拍摄照射后的纸张表面。通过使用Image J（美国国立卫生研究院，Bethesda，MD）对纸张上激光诱导微束的大小和分布进行量化。

2.2模型实验

通过在70°C蒸馏水中使用10%（w/v）猪皮明胶（凝胶强度300，A型；Sigma Aldrich，St，Louis，MO，USA）制备组织模型用于比较实验。首先，将明胶粉末倒入蒸馏水中，搅拌25分钟。然后，将0.03% w/v黑色素（synthetic; Sigma Aldrich, St, Louis, MO, USA）作为发色团加入到溶解的混合物中。当黑色素充分融化时，把混合物倒入5 cm3的模具中，在4℃下保存12小时使其凝固。制备的透明模型用于表征微光束的2D空间分布和激光诱导微气泡的轴向分布。为了评估LIOB诱导的反应，将在不同条件下具有MLA和DOE的单个皮秒脉冲照射在组织的模型上。对每个处理过的模型顶面和横截面进行拍照，识别微束斑的空间分布，并探索模型中激光诱导微气泡的轴向分布。用Image J测量所有微泡的尺寸和深度，对MLA和DOE之间进行定量比较。测量每个宏观光束内部的总气泡面积，对比研究微气泡的形成与施加的H0和光束分布的关系。

2.3离体皮肤测试

体外测试中，深色小型猪皮肤组织从CRONEX Crop（韩国首尔）获得，因为猪皮组织的散射率与人皮肤的散射率相当（猪真皮层的散射率为1.1mm-1，人真皮层的散射率为1.34mm-1，波长为1064nm）。用MLA和DOE辅助1064nm皮秒激光在H0=3.0和6.0J/cm2的能量密度下，在皮肤组织上进行照射。

每个脉冲照射后，将组织横向移动10µm，总治疗长度为200µm（总20次）。重叠照射可使激光诱导的空泡化在皮肤内有明显的空间分布。捕获俯视图像以测量微束在皮肤表面上的空间分布，从而对MLA和DOE之间进行定量比较。在体外实验后，所有处理过的组织样品在 10%中性缓冲福尔马林（Sigma Aldrich, St, Louis, MO, USA）中固定两天，厚度切成5µm，用苏木精和伊红(H&E)染色。Image J用于描述内部激光诱导空泡化的大小和分布。使用100和400倍光学显微镜（Leica DM500, Leica, Wetzlar, Germany）拍摄所有组织切片。在非参数统计分析中，采用Mann-Whitney U检验分别进行两组和多组的比较，p<0.05被认为具有统计学意义。

结果

图1比较了不同条件下MLA和DOE在黑色调光纸上的空间光束轮廓。根据图1（a），MLA产生了由37个微束组成的圆形轮廓光束（直径4mm），而DOE产生了由49个微束组成的矩形轮廓光束（宽4mm）。不考虑FD的情况下，MLA和DOE都显示，随着H0的增加，整体束斑变得更加模糊。随着FD的增加，MLA在整个微束中没有明显变化，但是从整体光束的轮廓中观察到微束尺寸的显著变化。另一方面，随着FD的增加，DOE微束的尺寸增加。然而，对于所有H0，每个DOE微束尺寸沿着横向的整体光束都是可对比的。图1（b）展示了MLA和DOE在3.0 J/cm2条件下，照射的微束横向分布（从图1（a）中的红色虚线测量）。在不同FD下，MLA的微束尺寸分布偏差相对较大（17~41%）。微束尺寸的平均值为~214µm。相比之下，在所有FD的微束尺寸分布中，DOE表现出相对较小的偏差（1~9%）。随着FD的增加，平均DOE微束尺寸从229μm增加到1009μm，表明与FD呈正相关。图1（c）显示了所有FD的总体MLA微束尺寸相对不变，但总体DOE微束尺寸随FD显著增加（p<0.001 vs MLA）。

图1.微透镜阵列（MLA）和衍射光学元件（DOE）在不同能量密度（H0，单位为J/cm2）和聚焦深度（FD，单位为mm）下的空间光束轮廓的比较：

（a）黑色调光纸上的整体光束光斑的俯视图像，（b）从整体光束（H0=3.0/cm2）的中线（红色虚线）获取的微观光束尺寸的空间分布，以及（c）从整体光束测量的总体微观光束尺寸（bar=2mm；***p<0.001 vs. MLA）。（b）中的灰色区域表示测量的微束尺寸偏差。

图2显示了在不同条件下，用MLA和DOE生成LIOB后组织模拟模型的消融反应。与图1（a）类似，图2（a）证明了MLA和DOE分别在模型表面产生圆形和矩形轮廓的光束。MLA和DOE均显示，在FD=0mm时，模型表面上能够清晰地产生激光诱导的微气泡。然而，随着FD增加，表面上微气泡开始消失，这表明微气泡的位置位于模型内部更深处。不考虑FD的情况下，由于单个微泡尺寸的增加，MLA和DOE产生的微泡伴随着H0的增加而出现更多的斑点区域。图2（b）比较了用MLA和DOE以4.5 J/cm2照射后，从处理模型表面中线（红色虚线）获得的激光诱导微气泡的尺寸和分布。MLA产生了不均匀的分布，偏差为33～44%。较大微泡尺寸出现在MLA整体光束的中心（平均微泡尺寸=～291μm），并且所有FD的MLA微泡总体尺寸是一致的。另一方面，DOE产生的微气泡分布均匀，偏差很小，为2∼5%。随着FD的增加，DOE微气泡的平均尺寸从190μm增加到546μm。值得注意的是，来自MLA和DOE的微气泡的变化趋势与图1（b）所示的微束斑的趋势一致。图2（c）显示了在FD=0mm（图2（a）中的青色虚线）时，在每个整体束斑内产生的微气泡的相对面积（覆盖率，单位为%），作为MLA和DOE的H0的函数。在MLA中，FD=0mm时，微气泡的覆盖率随H0略微增加。相反，DOE诱导的微气泡获得了更大的整体光束覆盖率（高达40%）。在FD=0mm（R2=0.92）时，两组的气泡覆盖率随H0线性增加。

图2.在不同能量密度（H0，单位J/cm2）和聚焦深度（FD，单位mm）下用MLA和DOE照射后，对基于明胶的皮肤模型（10%浓度的明胶和0.03%w/v的黑色素粉末）的激光诱导响应的评估：

（a）模型表面上的整体束斑（青色虚线）的俯视图（bar=2mm），（b）从整体光束斑点（H0=4.5/cm2）中线（红色虚线）获得的微气泡尺寸空间分布，以及（c）FD=0mm（R2=0.92）时每个整体光束斑点中微气泡覆盖率的比较。

（b）中的灰色区域表示测量微气泡的尺寸偏差。

图3显示了在不同条件下，使用MLA和DOE进行激光治疗组织模型的横截面图像。根据图3（a），MLA和DOE的微气泡深度随H0增加。在MLA的情况下，深度也随着FD的增加而变深。微气泡分布呈抛物线波动，大深度出现在整体光束中心。另一方面，DOE在FD=5mm时产生了大微气泡深度，且与H0无关。与MLA不同，DOE微气泡分布在任何条件下都具有平坦的末端轮廓。图3（b）对比了在不同FD（H0=4.5J/cm2）下，测量的激光处理模型横截面图像上微气泡的轴向分布。类似地，MLA形成了类高斯分布（13∼74%偏差），其随FD显著增加（FD=10mm时，大深度=7023μm）。然而，DOE得到了微气泡深度的平顶轮廓，大深度（∼5312μm）出现在FD=5mm处，偏差很小，为1∼5%（FD=0mm时，大深度为2036μm；FD=10mm时，大深度为3142μm）。图3（c）显示了MLA和DOE在不同条件下估计的总体微气泡深度。MLA的总深度随H0和FD显著增加。尽管DOE导致整体微气泡深度随H0增加，但大深度始终在FD=5 mm处。无论H0和FD如何改变，由于微气泡分布不均匀，MLA整体微气泡深度具有较大的标准偏差。相反，DOE仍然为较小的偏差（1∼16%）。

图3.在不同能量密度（H0，单位J/cm2）和聚焦深度（FD，单位mm）下用MLA和DOE照射明胶皮肤模型后，对其激光诱导响应的评估：

（a）模型中激光诱导微气泡的横截面图像，（b）在不同聚焦深度（垂直方向；H0=4.5J/cm2）下测量的微气泡轴向分布，以及（c）MLA和DOE之间总体微气泡深度的定量比较。注意，（a）中的青色虚线表示模型中激光诱导微气泡的端部轮廓（bar=2 mm）。

图4显示，在各种条件下，用MLA和DOE照射后的离体色素皮肤。根据图4（a），MLA在皮肤表面上产生圆形轮廓束斑，而DOE产生矩形轮廓束斑，这与图1（a）和2（a）一致。在MLA的情况下，微束斑随着H0和FD的增加变得模糊。然而，DOE在3.0和6.0 J/cm2之间的微束中没有明显的变化，但微束斑点尺寸随着FD的增加而增加。两组都与组织表面的浅表热损伤（发白）有关。图4（b）显示，以3.0 J/cm2辐照的MLA和DOE微束横向分布。MLA在所有FD下的微束尺寸分布都有较大的偏差（26∼28%）。随着FD的增加，MLA微束的平均尺寸从220μm增加到397μm。相比之下，DOE表现出相对较小的偏差（2∼5%）。随着FD的增加，DOE微束的平均尺寸从165μm增加到730μm，这表明与FD的相关性更强。根据图4（c），DOE组证明，与MLA组相比，FD组的整体微束尺寸增加得更明显，并且在FD=5和10mm时，整体尺寸是MLA组的两倍（p<0.001 vs. MLA）。

图4. 在不同能量密度（H0，单位J/cm2）和聚焦深度（FD，单位mm）下，用MLA和DOE照射离体着色猪皮肤后激光诱导响应的比较：

（a） 激光照射皮肤表面的俯视图图像，（b）从整体光斑的中线（红色虚线）获取的微束尺寸的空间分布（H0=3.0J/cm2），以及（c）从整体光斑测量的总体微束尺寸（H0=3.0 J/cm2）。注意，（a）中的青色虚线表示皮肤表面上的整体光斑的边界（条形=2 mm；***p<0.001 vs.MLA）。（b）中的灰色区域表示测量的微束尺寸偏差。

图5显示了，在H0=3.0和6.0J/cm2条件下，不同FD下使用MLA和DOE进行激光处理皮肤的H&E染色图像。图5（a）显示，在不同条件下都产生了激光诱导的空泡。在FD=0mm时，MLA在3.0和6.0 J/cm2下，表皮和真皮中随机产生一组大空泡。在FD=0和5mm时，随着表皮消融，能够观察到空泡较深、空泡大小一致，但在FD=10mm时，空泡变得越来越浅和越来越小。另一方面，DOE在FD=0mm时，产生少量轻度表皮内空泡以及表皮表面烧蚀。在FD=5和10mm时，基底膜下均匀地分布着相对密度较高的小空泡。图5（b）比较了三种FD下皮肤中激光诱导空泡的深度、大小和数量（H0=3.0 J/cm2）。MLA在FD=10mm（321±110μm）时，空泡深度明显变浅，而DOE在FD=5mm时，空泡深度大（FD=5mm时，空泡深度为349μm，而FD=0mm时，空泡深度为149μm，FD=10mm时，空泡深度为236μm），但仍浅于MLA（FD=0mm时，p<0.01）。此外，MLA产生的空泡比DOE大两倍（MLA=∼163μm，DOE=∼64μm；当FD=0mm时，p<0.05；FD=5和10mm时，p<0.001 vs. MLA）。DOE诱导的空泡大小是一致的，且与FD无关。尽管空泡的数量最少，但随着FD（FD=5和10mm）的增加，DOE明显产生了更多的空泡。表1总结了当前测试中MLA和DOE之间，激光诱导参数与H0和FD的相关性。通过每个参数与H0或FD之间的线性增加趋势来确定相关性（例如，当R2≥0.85时记为Y(+)）。

图5. 用MLA和DOE以H0=3.0和6.0 J/cm2照射不同FD后，深色猪皮肤的组织学分析：

（a）激光照射皮肤组织（100×和bar=200µm）的组织学图像，以及（b）组织学图像中激光诱导微气泡深度、大小和数量的定量比较（H0=3.0 J/cm2；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001 vs. MLA）。注意，（a）中的入口（400× 和bar=50µm）表示皮肤表面的放大区域（浅绿色虚线），BM表示基底膜的位置。

表1. 激光诱导参数与能量密度（H0）和聚焦深度（FD）的相关性

讨论

本研究的目的是对比评估在高能1064nm皮秒激光辐照后，MLA和DOE对离体色素沉着猪皮的LIOB效应。由于每个微束的辐照度范围为1.4×103至5.4×103GW/cm2，因此，无论什么样的靶目标，在辐照期间都会持续产生LIOB。高能量设置也让微气泡在模型中深度分布和在皮肤组织中激光诱导空泡得以实现（图3和图5）。然而，值得注意的是，模型中微气泡分布的程度很难反映组织中的空泡化程度。目标材料的光学特征（相对透明的模型 vs. 混浊的组织）可以解释空间分布的差异。初步测量证实，与MLA相比，DOE由于光束均匀化导致损失~15%的能量。因此，调节施打的脉冲能量来补偿DOE的能量损失，并在MLA和DOE照射期间提供等效的输出能量和H0（高达6.0J/cm2）。然而，由于微束数量的差异（MLA为37束，DOE为49束），在相同H0条件下，MLA的微束能量大约比DOE高10%。调光纸和组织模型均证实，DOE辅助LIOB启动后，DOE均匀分布的微束有助于微气泡的平顶分布（图2和3）。因此，具有高能量级的多个DOE微束（即，高达20.5mJ/微束）可在离体猪皮（深度为300∼400μm；图5）形成深且密度更高的均匀恒定空泡(大小∼50μm）。应注意的是，DOE辅助照射产生的深且均匀的空泡化，有望实现真皮深层靶色素的一致性和可预测消融。与MLA组不同，DOE组空泡深度明显与FD相关，这是因为激光诱导空泡化的大深度和密度发生在FD=5mm（图5）。目前的研究结果表明，在不同的皮肤质地下，DOE可能需要更深入的聚焦来实现激光诱导空泡的较大化。但需要对不同FD进行额外测试，以阐明DOE辅助皮秒激光治疗期间的LIOB效应，并优化最终的治疗结果，使真皮深层持续空泡化。

增加H0使入射皮秒激光穿透到更深的组织，但同时也会对皮肤表面产生不可逆的损伤（图4）。特别是，在H0=6.0J/cm2的MLA辅助皮秒激光治疗，证明了表皮和真皮有明显的表面消融（图4和图5）。此外，较高的FD放大了目标表面（纸、模型和皮肤组织）上的微束点，从而失去了部分DOE光束的积极效果。本研究使用MLA和DOE对皮肤进行多次连续的激光治疗（移动20µm，共10次），以产生用于定量比较和可视化的一系列空泡。然而，多个微束的重叠（直径∼200μm）导致组织表面热损伤的累积（图5（a）），扩大了损伤程度（发白；图4（a））。此外，与之前在低能量下进行单次治疗的研究不同，在高能量设置下的测试中，没有观察到明显的等离子体屏蔽，这是因为MLA和DOE的空泡化深度随H0的增加而增加（表1）。由于LIOB诱导的效应会在组织中累积，多种治疗可以共同抑制辐照期间等离子体屏蔽对空泡化（大小和分布）的影响。然而，为了证实这个发现，需要额外进行无波束重叠的单次和多次治疗。因此，为了避免表面过度烧蚀或热损伤，了解高能量设置下等离子体屏蔽效应，保持具有MLA和DOE的LIOB的当前空间效应，需好的治疗条件。有趣的是，无论H0和FD如何变化，这两组空泡的大小不变(MLA为∼160μm vs. DOE为∼90μm）。尽管在相同条件下，DOE约小40%，但与MLA相比，DOE与分布（FD=5mm）、恒定的空泡尺寸（偏差较小）和更高的空泡数量相关性更高（图5（b））。DOE的恒定微束模式可以保持单个微束的等效能量，并最终在组织产生大量一致的真皮内LIOB。

先前的许多研究，报告了皮秒激光治疗对离体和人体皮肤组织的影响。Lee等人用H0=2.8J/cm2的MLA（整体光斑直径=7mm）1064nm皮秒激光在离体猪皮组织上测试。研究表明，MLA辅助的1064nm皮秒激光产生的空泡（大小为28±10μm）不均匀地分散在猪皮组织中（深度为145±26μm）。尽管空泡大小相当，但其位置比本次MLA结果要浅得多（H0=3.0 J/cm2时，大小=∼163μm，深度=∼350μm）。Yeh等人还用MLA测试了1064nm皮秒激光，在H0=1.2 J/cm2的人体皮肤中产生空泡(尺寸∼50μm，位于50∼100μm）。与本次MLA结果（高达6.0 J/cm2）相比，所产生的空泡较小，且在表皮中分布较浅。尺寸差异可能由多种因素造成，包括皮肤类型的光学特性（人体组织与离体猪组织）、微束能量水平（超两倍的差异）以及LIOB的特性（数量、深度和大小）。另一方面，Tanghetti等人提出，具有DOE的1064nm皮秒激光在H0=1.1 J/cm2条件下，诱导人表皮产生40μm~60μm的空泡。Balu等人也在H0=0.8J/cm2（整体光斑直径=6mm）的DOE辅助1064nm皮秒激光照射后，使用多光子显微镜观察了49±11μm的人类表皮中激光诱导空泡。尽管空泡大小相当（40∼60μm），但之前的DOE研究将激光诱导的空泡化，限于应用低微束能量或H0的表皮。另一方面，本研究测试了高脉冲能量设置（H0=1.5∼6.0 J/cm2），研究皮肤中的真皮内LIOB效应对MLA和DOE的依赖性，并最终评估消融深层黑色素的潜在能力。尽管对FD的依赖性很强，但DOE组表明了，在基底膜（深度300∼400μm）下有大小一致(∼78μm）且均匀分布的高密度激光可诱导空泡。当前研究结果表明，在高能量环境下，DOE辅助的皮秒激光能治疗深层皮肤色素。应进一步对人体皮肤进行测试，确认本次实验的发现，以保证皮肤科医生的临床效果。

尽管显示DOE辅助的皮秒激光在基底膜下，激光诱导的空泡分布更均匀，但仍存在临床实验限制。实验中使用的所有靶目标都具有相对平坦的表面，以便在镜面反射最小的情况下实现更好的光学耦合。然而，MLA可以在粗糙表面上沉积和使用入射激光能量，而DOE可以在平坦表面上很好地工作。因此，作为一个重要的临床参数，应检查各种表面条件（例如，光滑与粗糙），以验证MLA和DOE的当前发现。由于本研究测试了猪的色素性皮肤，而离体组织在黑色素分布、含水量、血流灌注和皮肤温度方面几乎不能反映体内和人体组织状况。事实上，皮肤颜色的光学特性变化可能会改变皮肤组织上LIOB的阈值和特性。缺乏皮肤血流的话，很难评估浅表皮的出血，特别是在高能激光治疗后。本次研究仅仅用了深色猪皮来确保在所有条件下启动LIOB。因此，应评估其他皮肤类型/颜色，以阐明DOE诱导的LIOB对黑色素含量和分布的依赖性。仅选择三种不同的FD来模拟人体皮肤质地（即表面状况）对真皮内LIOB反应的影响。然而，激光诱导的空泡化对FD的非线性依赖性（图5）需要测试各种治疗距离，以保证DOE辅助激光治疗的好临床结果。因此，对于潜在的临床转化，需进行进一步的研究，以验证本次在具有多种肤色猪体内模型中的发现，包括去除色素的程度，使用MLA和DOE的激光治疗对皮肤的急性和慢性反应以及色素治疗后的复发率。

结论

本次研究通过使用MLA和DOE辅助的皮秒激光系统，比较了在高能量环境下离体皮肤组织的LIOB效应。尽管对FD有很强的依赖性，但DOE产生了微光束空间的均匀分布，并在真皮内LIOB后，导致基底膜下激光均匀地诱导空泡化。之后进一步的研究，将验证DOE辅助的皮秒激光治疗活体猪皮肤模型，在用于临床转换的潜在有效性和安全性。

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